Virkningsmekanismen er hemming av proteinsyntese ved å binde seg til 30S ribosomal subenhet av mikroorganismer som er mottakelige for
oksytetracyklin, og dermed
hindrer forbindelsen mellom ribosomer og aminoacyl-tRNA. Det antas også at oksytetracyklin binder seg omvendt til 50S ribosomer og endrer permeabiliteten til den cytoplasmatiske membranen til sensitive mikroorganismer. Oksytetracyklin kan også hemme proteinsyntese i celler i høye konsentrasjoner.